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蛋白质浓度测定常用比色法。其中，BCA法和Bradford法定量是最常用的蛋白浓度测定方法。每种蛋白质定量方法都有其局限性，在选择蛋白质定量方法时，最需要考虑的特性是灵敏度、与样品中常见物质的相容性(如洗涤剂、还原剂、抑制剂、盐和缓冲液)、标准曲线线性和蛋白质之间的差异等。

蛋白定量BCA法和Bradford法对比

	BCA法	Bradford法
测定范围	20–2000 μg/mL	100-1500 μg/mL
检测原理	在碱性的条件下，蛋白质将碱性Cu(II)还原为Cu(I)。两分子的二辛可宁酸（BCA）螯合一个Cu(I)，形成紫色的反应复合物。该复合物的水溶液在562nm处显示强烈的吸光性	在试剂的酸性环境中，蛋白能与考马斯染料结合。这导致染料的最大吸收发生位移，从红棕色形式转化为蓝色形式。蛋白-染料结合物在595nm波长下吸收最大
优点	兼容大多数去垢剂	蛋白定量方法中，测定最快速，方法最简单，且在室温下进行
优点	蛋白质间差异性小于Bradford法	与大多数盐离子、溶剂、缓冲剂、硫醇、还原性物质和金属螯合剂兼容
缺点	能还原铜离子的物质也能造成显色，影响定量的准确性	与通常用于溶解膜蛋白的高浓度去垢剂不兼容
	与铜离子螯合的试剂，DTT 等常见还原剂和特定的单个氨基酸也会在BCA检测中显色（半胱氨酸或胱氨酸、酪氨酸和色氨酸）	与BCA法相比，蛋白质之间的差异性较大
	需要孵育温度以及时间的消耗	-

试剂配制：

1、BCA试剂

A）试剂A：分别称取1%(w/v)BCA ，2%(w/v)Na2CO3·H2O，0.16%(w/v)Na2C4H4O6·2H2O，0.4%(w/v)NaOH，0.95%(w/v)NaHCO3，用NaOH或固体NaHCO3调节pH值至11.25。

B）试剂B：4%(w/v)CuSO4·5H2O。

C）BCA试剂：试剂A:试剂B=50:1,混合均匀。

2、牛血清蛋白标准（BSA）标准蛋白质母液：配制成5mg/ml的BSA标准溶液（配制溶液需与待测样品溶液保持一致）。

实验操作：

1、配制标准曲线待测样品：用标液配置溶液稀释BSA母液10倍，至浓度为0.5mg/ml。取96孔酶标板，按下表加入试剂

每份标样分别加入BCA试剂200μl。

2、配制待测样品：准确吸取20μl样品溶液于酶标孔中，加入BCA试剂200μl。如待测样品需稀释，稀释倍数需根据原始样品浓度进行适当调整，一般保证稀释后样品浓度标曲浓度范围内。

3、样品处理：轻摇，于37℃保温30-60min，冷却至室温。

4、测定：以空白为对照，在酶标仪上562nm处比色，以牛血清白蛋白含量为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。以标准曲线空白为对照，根据样品的吸光值从标准曲线上查出样品的蛋白质含量。

BCA法试剂

1、染色剂：0.01％考马斯亮蓝G250,8.5%磷酸和4.75%乙醇。

2、牛血清蛋白标准（BSA）标准蛋白质母液：配制成10mg/ml的BSA标准溶液（配制溶液需与待测样品溶液保持一致）。

A）在BSA母液中加入标液配置溶液，配置一组浓度分别为0mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml的BSA溶液。

B）对于上述配制好的BSA溶液，再用P标液配置溶液分别稀释10倍。

C）分别移取50μl步骤B中配制好的一组待测标准BSA溶液，滴加到孔板中，再分别加入200μl考马斯亮蓝G250。静置10min后检测。

2、配制待测样品：准确吸取50μl样品溶液于孔板中，加入考马斯亮蓝G250试剂200μl。静置10min后检测。如待测样品需稀释，稀释倍数需根据原始样品浓度进行适当调整，一般保证稀释后样品浓度在0.1-1.0mg/ml。

3、用酶标仪在595nm波长下测定溶液的吸光度。以BSA含量为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。以标准曲线空白为对照，根据样品的吸光值从标准曲线上查出样品的蛋白质含量。

Bradford法试剂