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阿拉丁SDS-PAGE蛋白电泳试剂
2020-05-27
十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是一种常用的蛋白电泳。经典SDS-PAGE蛋白电泳凝胶，由两种不同浓度的丙烯酰胺溶液形成的不连续凝胶（浓缩胶和分离胶）。
1、凝胶材质
聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺单体聚合而成的聚合物，通常与双丙烯酰胺或N,N'-亚甲基双丙烯酰胺结合使用。 交联剂双丙烯酰胺含有两个单位通过亚甲基桥连的丙烯酰胺。 聚合是被TEMED催化（N,N,N,N-四甲基乙二胺）的自由基反应-通常由过硫酸铵(APS)引发。在既定温度下，APS和/或TEMED的浓度决定了聚合速率。
蛋白电泳，通常采用30%或30%+(%T)的聚丙烯酰胺凝胶。通过改变基质的百分比来调整孔径大小，从而有效分离不同大小的蛋白。聚丙烯酰胺凝胶的含量与蛋白大小成反比。
分离胶中丙烯酰胺比例和分离蛋白大小的关系
| 丙烯酰胺比例 | 8% | 10% | 12.5% | 15% | 20% |
|---|---|---|---|---|---|
| 分离蛋白范围 | 25-200 KDa | 15-100 KDa | 10-70 KDa | 6-60 KDa | 4-40 KDa |
2、变性剂
SDS是一种阴离子去污剂。SDS-PAGE蛋白电泳中,SDS与蛋白质紧密集合,将蛋白质的氢键、疏水键打开,引起蛋白质构想的改变,其所带的电荷与蛋白质有大大的差异,因此消除或掩盖了蛋白质本身的电荷。电泳时的蛋白的迁移率就不在受蛋白质原有的电荷和形状的影响,而只与蛋白质大小有关。
常用SDS-PAGE蛋白电泳分离胶和浓缩胶配置表
| 溶液成分（mL) | 5%浓缩胶 | 不同浓度的分离胶 | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 6% | 8% | 10% | 12% | 15% | ||
| 水 | 6.8 | 20 | 16.7 | 13.3 | 10 | 5 |
| 30%Acr-Bis(29:1) | 1.7 | 10 | 13.3 | 16.7 | 20 | 25 |
| 1M Tris(pH=8.8） | - | 19 | 19 | 19 | 19 | 19 |
| 1M Tris(pH=6.8） | 1.25 | - | - | - | - | - |
| 10% SDS | 0.1 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| 10% 过硫酸按 | 0.1 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| TEMED | 0.01 | 0.04 | 0.03 | 0.02 | 0.02 | 0.02 |
| 总体积（mL) | 10 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
凝胶配置试剂
| 产品号 | 名称 | 级别 | Cas | 规格 |
|---|---|---|---|---|
| A108470 | 丙烯酰胺 | 电泳专用级 | 79-06-1 | 25g,100g,500g |
| M104026 | N，N′-亚甲基双丙烯酰胺 | 电泳级, ≥99.0% (T) | 110-26-9 | 25g,100g,500g |
| T105496 | 四甲基乙二胺(TEMED) | 用于电泳,99% | 110-18-9 | 25ml，100ml |
| A112447 | 过硫酸铵APS | 99.99% metals basis | 7727-54-0 | 25g,100g,500g |
| S108346 | 十二烷基硫酸钠(SDS) | 电泳专用,≥98.5% (GC) | 151-21-3 | 25g,100g,500g，2.5Kg |
3、电泳缓冲液
经典SDS-PAGE蛋白电泳缓冲体系（Tris Glycine）工作原理：
上层浓缩胶，由较低浓度丙烯酰胺溶液形成（一般丙烯酰胺浓度为4-6%）。浓缩胶体系中的氯离子（Cl-）作为先导离子，以较快的速度向正极迁移。在其后面形成一个电导较低、电位梯度较陡的区域，加快了蛋白质和甘氨酸离子（Gly)的迁移。由于浓缩胶中的pH较低（一般pH=6.8），甘氨酸的负离子效应不明显，作为尾随离子，迁移较慢。所以，进入分离胶之前，蛋白堆积在氯离子、甘氨酸离子之间，有利于提高电泳的分辨率。
进入下层分离胶后，pH升高(分离胶通常pH=8.8)，使甘氨酸解离成负离子效应增加，使甘氨酸的迁移超过蛋白质。另外，由于分离胶中的丙烯酰胺浓度明显高于浓缩胶，一般丙烯酰胺浓度为8-15%。蛋白质便在一个较均一的pH和电压梯度环境中，按其性质分离。在非变性蛋白凝胶电泳中，按荷质比分离蛋白。在SDS-PAGE变性蛋白凝胶电泳，按相对分子质量大小分离蛋白质。
Tris Glycine缓冲体系电泳缓冲液组分
| 组分 | Tris base | 甘氨酸 | SDS | 去离子水 | (pH 8.3) |
|---|---|---|---|---|---|
| 浓度 | 25 mM | 192mM | 0.10% | — |
电泳缓冲液配置试剂
| 产品号 | 名称 | 级别 | Cas | 规格 |
|---|---|---|---|---|
| T110601 | 三(羟甲基)氨基甲烷 | 分子生物学级,≥99.9%(T) | 77-86-1 | 500g，1Kg |
| A110752 | 甘氨酸 | 用于电泳,≥99% | 56-40-6 | 500g，2.5Kg |
| S108346 | 十二烷基硫酸钠(SDS) | 电泳专用,≥98.5% (GC) | 151-21-3 | 25g,100g,500g，2.5Kg |
除了(Tris-甘氨酸)缓冲系统，聚丙烯凝胶蛋白电泳缓冲系统也衍生出了一系列进化缓冲系统。Tricine缓冲系统中，用Tricine替代了传统Tris-甘氨酸系统中的甘氨酸，使得低分子量蛋白（2-20 kDa）电泳具有更高的分辨率。Tris-醋酸盐凝胶可以用于大分子量蛋白（＜500 kDa）的分离。
4、蛋白染料
考马斯亮蓝R250染料是SDS-PAGE中最常用的蛋白染色之一。蛋白质-染料复合物在549纳米处有最大的吸收。每个正电荷氨基酸约1.5-3个考马斯亮蓝R250分子将被结合。灵敏度在200-400ng左右。而考马斯亮蓝G250主要应用是Bradford法(测定蛋白质浓度)，但也可以对聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质进行染色。
蛋白染料
| 产品号 | 名称 | 级别 | Cas | 规格 |
|---|---|---|---|---|
| C298550 | 考马斯亮蓝染色液 | - | - | 100ml |
| C298551 | 考马斯亮蓝快速染色液 | 0.1%（W/V） | - | 100ml |
| B105005 | 考马斯亮蓝R250 | 电泳级,≥90 %(HPLC) | 6104-59-2 | 5g,25g,100g |
| B104241 | 考马斯亮蓝G250 | 70%,用于电泳 | 6104-58-1 | 5g,10g,50g,250g |
| C298552 | 考马斯亮蓝脱色液 (40%甲醇，10%冰醋酸) | - | - | 100ml |
5、上样缓冲液
上样缓冲液通常包含密度成分、SDS、染料、缓冲体系。密度成分帮助样品沉入凝胶孔中，SDS是一种阴离子去污剂，染料则用于指示电泳的进展。对于还原蛋白电泳，还需在上样缓冲液中加入还原剂，降低二硫键的生成。
| 组分 | Tris HCl | 甘油 | SDS | 溴酚蓝 | 二硫苏糖醇（DTT） | 去离子水 | (pH 6.8) |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 浓度 | 63 mM | 10% | 2% | 0.00% | 0.1 M（还原蛋白电泳） | — |
上样缓冲液组分
| 产品号 | 名称 | 级别 | Cas | 规格 |
|---|---|---|---|---|
| T105291 | 三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris HCl) | 用于分子生物学和细胞培养,≥99.0%(AT) | 1185-53-1 | 100g,500g |
| G118851 | 甘油 | 无菌,for molecular biology | 56-81-5 | 100ml |
| S108346 | 十二烷基硫酸钠(SDS) | 电泳专用,≥98.5% (GC) | 151-21-3 | 25g,100g,500g，2.5Kg |
| B109645 | 溴酚蓝 | Indicator | 115-39-9 | 10g,25g,50g |
| D104861 | DL-二硫苏糖醇(DTT) | 用于电泳,≥99% | 3483-12-3 | 1g,5g,25g |
