【阿拉丁】免疫印迹实验步骤（Western Blot）

   

         蛋白印迹实验 (WB) 广泛用于分析细胞或组织提取物中的特异性蛋白表达。蛋白印迹实验很耗时，而且它们的成功对研究进展有着重要影响。为此，我们在开发抗体时深思熟虑，提供优化的实验步骤以及参考信息和技术支持，以使您的蛋白印迹实验获得成功。

注：请参阅一抗产品网页，了解推荐的一抗稀释缓冲液和抗体稀释度。

 

A. 溶液与试剂

注：利用反渗透去离子水或同等级别的水制备溶液。

1. 20 × 磷酸盐缓冲液 (PBS)：（P492453）为了制备1 L 1 × PBS：添加50 mL 20 × PBS至950 mL dH2O，然后将其混匀。

2. 10× Tris 盐缓冲液 (TBS)：（T397928）要制备 1 L 1× TBS：向 900 mL dH2O 中添加100 mL 10×，然后混匀。

3. 1× SDS 样品缓冲液：SDS-PAGE上样缓冲液（S750311）将 SDS-PAGE 上样缓冲液（还原，6×）与蛋白样品按照 1：5 的比例混匀。将蛋白样品置于沸水浴中加热 3-5 分钟。待蛋白样品充分变性后冷却至室温，以小于 3000 rpm 的条件离心30 秒。以取适量上清

4. 10× Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液：（S301872）要制备1 L 1 × 电泳缓冲液：向900 mL dH2O中添加100 mL 10× 电泳缓冲液，然后混匀。

5. 10× Tris-Glycine 转移缓冲液：（T492968）要制备 1 L 1× 转移缓冲液：向 200 mL 甲醇 + 700 mL dH2O 中添加 100 mL 10× 转移缓冲液，然后混匀。

6. 1× Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST)：含有20 mM Tris, 137 mM NaCl, 0.1% Tween-20，pH7.6±0.1 (25℃)。

7. Tween 20（T434505）

8. 脱脂奶粉（N752146）。

9. RIPA Lysis Buffer（R493085）

10. 封闭缓冲液：含 5% w/v 脱脂奶粉的 1× TBST；要制备 150 mL，向 150 mL 1× TBST 中添加 7.5 g 脱脂奶粉并充分混匀。

11. 洗涤缓冲液：1× TBST。

12. 牛血清白蛋白（BSA）：（B265993）

13. 磷酸酶抑制剂混合物（P777310）

14. 蛋白酶抑制剂混合物（P301902）

15. 30%丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液 （A665714）

16. 过硫酸铵（A112450）

17. PAGE凝胶快速制备试剂盒（推荐，原因比较便捷）（P777326）

18. UltraBio? SDS-PAGE预制胶（Tris-Gly）（推荐，更为便捷）（E753596）

19. UltraBio? SDS-PAGE预制胶 (Bis-Tris) 推荐，更为便捷，注意缓冲液为MOPS-SDS Running Buffer T767955）（U776776）

20. 一抗稀释缓冲液：含 5% BSA 或 5% 脱脂奶粉的 1× TBST（如一抗产品网页所示）；如要制备 20 mL，往 20 mL 1× TBST 中添加 1.0 g BSA 或脱脂奶粉，并充分混匀。

21. 蓝色预染蛋白分子量标准 (10-250kda)：（rp210256）。

22. 印迹膜和纸：PVDF膜。通常推荐 0.22 μm（P766356） 孔径或0.45μm（P766361）孔径。

23. HRP 偶联二抗：抗兔 (Ab176443)；抗小鼠(Ab179001)。

24. 检测试剂：ECL Plus 超敏发光液（E266188皮克级、W266209飞克级）

 

B. 蛋白质印迹

         制备样品的常规流程：

（1）悬浮细胞裂解总蛋白的制备方法

         1. 从二氧化碳培养箱中取出培养皿镜下观察细胞，确定细胞覆盖率>70%且状态良好。

         2. 根据需要的体积配制细胞裂解工作液，配制过程在冰上进行；例如配置50mL的裂解工作液需要在50mL的RIPA Lysis Buffer加入0.5mL蛋白酶抑制剂混合物（P301902），并根据实验需要加入合适的磷酸酶抑制剂，混匀后在当日内使用。

         3. 将培养瓶内细胞收集于离心管中，1200rpm 5min离心收集细胞

         4. 在离心管中加入40 mL预冷的DPBS，清洗细胞后离心去上清，清洗两次。

         5. 将适量体积的裂解液和收集的细胞混合，轻轻吹散细胞，4℃旋转培养仪上裂解30min。注：一般一个T75需要2至3mL裂解工作液。

         6. 重复直至所有细胞培养皿内的细胞收集完毕，4℃下在旋转培养器上旋转裂解30 min，使其充分裂解。

         7. 裂解完成后，4℃下8000 rpm高速离心20min。

         8. 弃沉淀收集上清，将收集到的裂解产物用0.45um过滤器过滤后收集于干净离心管并置于冰上，用BCA法进行蛋白浓度测定。

         9. 细胞裂解产物浓缩与稀释（该步骤针对浓度过高或者过低的Lysate）

         若浓度>2.5mg/mL,使用RIPA Lysis Buffer将其浓度稀释到在1.5-2.5 mg/mL之间。若蛋白浓度<1 mg/mL，转入步骤10-14。

         10. 超滤离心管使用前用移液枪吸取3mL PBS，轻轻吹打管壁和滤膜；配平后放入离心机，设置转速为5000G，离心5min。

         11. 从离心机中取出超滤离心管，倒净滤出和未滤出的PBS，倒入Lysate溶液，配平后将超滤离心管放入离心机，使滤膜方向正对转子中心。

         12. 设置转速为5000G，在超滤体积为15mL时离心20min（若裂解产物原始浓度异常低或高，则酌情增减离心时间）。

         13. 浓缩结束后，用移液枪吸出浓缩物，边吸边轻轻吹洗滤膜，放入干净的离心管中。

         14. 对浓缩好的细胞裂解液重新进行浓度测定，确定浓度在1-2.5mg/mL之间。按照需求进行分装，并做好标记。

 

（2）贴壁细胞裂解总蛋白制备方法

         1. 从二氧化碳培养箱中取出培养皿镜下观察细胞，确定细胞覆盖率>70%且状态良好。

         2. 根据需要的体积配制细胞裂解工作液，配制过程在冰上进行；例如配置50mL的裂解工作液：需要在50mL的RIPA Lysis Buffer中加入0.5mL蛋白酶抑制剂混合物（P301902），并根据实验需要加入合适的磷酸酶抑制剂，混匀后在当日内使用。

         3. 将培养皿置于冰上，用10mL移液管将培养皿中的培养基吸尽。

         4. 在培养皿中加入5mL预冷的DPBS，清洗细胞后吸走，每皿清洗两次。

         5. 每个培养皿加入细胞裂解工作液0.5-1mL，使用细胞刮子将裂解后的细胞从培养皿底部完全刮下来并收集到干净离心管内（离心管全程置于冰上）。

         6．重复直至所有细胞培养皿内的细胞收集完毕，4℃下在旋转培养器上旋转裂解30 min，使其充分裂解。

         7．裂解完成后，4℃下8000 rpm高速离心20 min。

         8．弃沉淀收集上清，将收集到的裂解产物用0.45um过滤器过滤后收集于干净离心管并置于冰上，用BCA法进行蛋白浓度测定。

         9. 细胞裂解产物浓缩与稀释（该步骤针对浓度过高或者过低的Lysate）

         若浓度>2.5mg/mL,使用RIPA Lysis Buffer将其浓度稀释到在1.5-2.5 mg/mL之间。若蛋白浓度<1 mg/mL，转入步骤10-13。

         10. 超滤离心管使用前用移液枪吸取3mL PBS，轻轻吹打管壁和滤膜；配平后放入5804R离心机，设置转速为5000G，离心5min。

         11. 从离心机中取出超滤离心管，倒净滤出和未滤出的PBS，倒入Lysate溶液，配平后将超滤离心管放入离心机，使滤膜方向正对转子中心。5.4.3 设置转速为5000G，在超滤体积为15mL时离心20min（若裂解产物原始浓度异常低或高，则酌情增减离心时间）。

         12.浓缩结束后，用移液枪吸出浓缩物，边吸边轻轻吹洗滤膜，放入干净的离心管中。

         13.对浓缩好的细胞裂解液重新进行浓度测定，确定浓度在1-2.5mg/mL之间。按照需求进行分装，并做好标记。

C．电泳

1．根据适用场景选择分离胶浓度 范围（kDa）   8% 50-200 超大分子（如纤维蛋白原） 10% 20-150 常规蛋白（如BSA、抗体） 12% 10-70 中等分子（如细胞因子） 15% 5-40 小分子（如多肽、酶切片段）

         2. 分离胶配制（以10%为例）

试剂 体积（10 mL） 30%丙烯酰胺混合液 3.3 mL 1.5 M Tris-HCl (pH8.8) 2.5 mL 10% SDS 100 μL 10%过硫酸铵（APS） 50 μL TEMED 5 μL

         操作步骤：混合前4种成分后轻柔旋涡混匀，加入TEMED后立即灌胶至玻璃板高度80%，用异丙醇或水覆盖表面隔绝氧气，室温静置30分钟

          3. 浓缩胶配制（5%）

试剂 体积（5 mL） 30%丙烯酰胺混合液 0.83 mL 1.0 M Tris-HCl (pH6.8) 1.25 mL 10% SDS 50 μL 10% APS 25 μL TEMED 3 μL

         操作步骤：倒掉分离胶上层液体，滤纸吸干残留，配制浓缩胶并灌满剩余空间，插入梳子避免气泡，静置20分钟

         也可选择阿拉丁PAGE凝胶快速制备试剂盒或UltraBio? PAGE预制胶更加便捷！

          4. 电泳条件：

          浓缩胶：80V恒压（约30分钟）

          分离胶：120V恒压（约1-1.5小时）

 

          5. 转膜（湿转法举例）

          PVDF膜用甲醇活化30秒

          凝胶-膜-滤纸"三明治"结构（避免气泡）

          4℃条件下100V恒压转膜60分钟（目标蛋白>50 kDa需延长至90分钟）

          验证方法：丽春红染色检查转膜效率，预染Marker条带观察

 

D. 膜封闭和抗体孵育

          封闭和抗体孵育

注：容量适用于10 cm × 10 cm（100 cm2）的膜；对于不同尺寸的膜，请相应调整容量。

         I. 膜封闭

         1. （可选）转移之后，在室温下用 25 mL TBS 将PVDF膜洗涤 5 分钟。

         2. 将膜置于 25 mL 封闭缓冲液中，在室温下孵育 1 小时。

         3. 用 15mL TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

         II. 一抗孵育

         根据所使用的一抗，继续下述其中一项的具体步骤。

         （1） 对于无偶联的一抗

         1. 将膜和一抗（按照产品官网中建议的适当稀释度和稀释液）置于 10 mL 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜或室温孵育1小时，并放置于摇床晃动。

         2. 用 15mL TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

         3. 按一抗来源选取合适的 HRP 偶联的二抗（(Ab176443或Ab179001），置于 10 mL 封闭缓冲液中孵育 1小时并放置于摇床搅动。

         4. 用 15mL TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

         5. 继续进行检测（D 部分）。

 

         （2）对于偶联有HRP 的一抗

         1. 将膜和一抗（按照产品数据表中建议的适当稀释度）置于 10 mL 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜或室温孵育1小时，并放置于摇床晃动。

         2. 用 15mL TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

         3. 如检测生物素化抗体或蛋白使用 Streptavidin-HRP在室温下于 10 mL 封闭缓冲液中孵育 1 小时并放置于摇床搅动。

         4. 用 15mL TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

         5. 继续进行检测（D 部分）。

 

         （3）对于生物素化的一抗

         1. 将膜和一抗（按照产品数据表中建议的适当稀释度）置于 10 mL 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并放置于摇床晃动。

         2. 用 15mL TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

         3. 将膜与 Streptavidin-HRP （np156148以适宜的稀释度）在室温下于 10 mL 封闭缓冲液中孵育 1 小时并放置于摇床晃动。

         4. 用 15mL TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

         5. 继续进行检测（D 部分）。

 

E. 蛋白质检测，ECL Western Blot Kit举例

         1. 二抗孵育完毕后，将印迹膜充分洗涤。

         2. 根据需要量，将ECL-A和ECL-B按照1：1的比例等体积混合，配制为化学发光检测底物工作液（一张10 cm × 10 cm的膜大约使用2mL工作液）。

         3. 弃去洗涤缓冲液，将发光底物工作液滴加在印迹膜上，确保工作液覆盖整张膜，室温孵育3-5分钟。

         4. 在暗室内进行×-光胶片曝光，或将膜放置到化学发光成像仪内，按照仪器说明书进行检测。

 

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