CLARITY(Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/Immunostaining/Insitu hybridization-compatible Tissue hYdrogel)是一种革命性的组织透明化与染色技术,通过结合水凝胶固定和脂质去除,实现了对完整生物组织的三维成像与分析。
CLARITY技术的主要用途是将完整的生物组织(如大脑、肝脏等)转化为透明状态,同时保留组织内的生物分子(如蛋白质、核酸等)的原位信息。这种技术使得科学家能够在不切片的情况下,对组织进行三维成像,观察神经网络、细胞间联系、亚细胞结构等细节。
CLARITY技术的核心原理是将组织浸泡在纳米多孔水凝胶中,使水凝胶与组织中的生物分子(如蛋白质、核酸等)形成共价键连接,从而固定组织结构。随后,通过电泳技术,利用带电的十二烷基硫酸钠(SDS)胶束去除组织中的脂质,使组织变得透明。最后,通过折射率匹配溶液(如FocusClear或甘油溶液)进一步优化透明效果。
组织选择
原则上,任何年龄、任何动物的任何组织类型(无论是否带有荧光)均可使用。在之前研究人员的论文报道中,证明了 CLARITY 兼容成年小鼠全脑、成年斑马鱼全脑以及福尔马林固定的死后人脑切片。
没有荧光蛋白的组织可以按照本方案描述用抗体或RNA探针标记,以便成像;如果是具有强荧光蛋白表达的组织,可以忽略本方案中免疫荧光染色的步骤进行CLARITY处理,然后经过折射率校正和封片后直接成像。
溶液制备
1.水凝胶单体溶液
将所有试剂放在冰上,将1 g水溶性偶氮引发剂(如VA-044)溶解在10 mL超纯水中,制备10%的引发剂溶液原液。
然后按照以下配方制备溶液(每份组织样本需要80 mL):
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注意,低温可以有效避免水凝胶聚合反应,所以整个过程中,确保所有试剂和最终溶液始终置于冰上。
该溶液可在-20°C下永久保存。
2.SDS透明化溶液
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使用硼酸将以上溶液的pH值调整至8.5。
3.PBST(含0.1% Triton-X 和 0.1% 叠氮化钠)
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4.折射率校正液
该溶液由23.5% (w/v) N-甲基-D-葡糖胺、29.4% (w/v) 泛影酸和 32.4% (w/v) 碘克沙醇在水中组成。
具体配方如下:
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注意:按照以上顺序添加试剂,每一步都需用搅拌棒充分搅拌,确保粉末完全溶解(必要时可摇晃,但不能加热,否则会导致溶液颜色改变)。
因少量水分蒸发就会导致沉淀,所以存放时可用胶带或者封口膜密封,切记不能让水分流失。
实验操作
第 1 阶段 灌注和组织准备
1.准备好新鲜配置的水凝胶单体溶液,如果是冷冻的原液,需要在4?C或冰上完全解冻至呈现完全透明的状态。
注意,确保溶液中没有沉淀或气泡。
2.用 beuthanasia-D(一般用量,腹膜内每1 kg体重0.5 mL)对动物进行深度麻醉。
3.利用手术刀打开胸腔,在腹部中线切口向前端分叉成Y形切口。然后在右心房打一个小孔,将注射针插入左心室进行灌注。
注意:涉及动物的实验必须遵守政府和机构的规定。动物在进行切口前必须完全麻醉。
4.准备两个注射器,分别装有冰冷的PBS和水凝胶单体溶液,每个溶液都有翼状针头组。
· 对于小鼠,先以小于5 mL/min的速度灌注20 mL冰冷的PBS,小心地拔出针头,再灌注20 mL冰冷的水凝胶单体溶液。
· 对于大鼠,则每种溶液需要约200 mL,并以20 mL/min的速度进行灌注。
注意:保持缓慢的灌注速度,效果更佳。
同时,灌注时一定要避免将气泡引入血管(尤其是在插入针头时)。
5.小心取出目标器官,立即将它们放入装有20 mL冰冷水凝胶单体溶液的50 mL锥形管中,并置于冰上孵育一天,以进行后固定和单体的均匀渗透。
6.将样品在4℃下孵育一天,以使单体和引发分子进一步分布在整个组织中。
第2阶段 水凝胶组织包埋
1.将在水凝胶单体溶液中孵育一天后的组织样品移至10 mL新鲜水凝胶单体溶液中。
2.将锥形管放入管架上的干燥室中,并将盖子拧开一半。以便去除水凝胶-组织杂交过程中的氧气,防止氧自由基终止聚合反应。
3 .通过三通旋塞阀将氮气和真空泵与干燥器连接,打开三个方向的气流并打开氮气,让气体流动约5秒钟,以冲洗管道中残留的氧气。
4.为避免氧气扩散回管道,在不关闭氮气流的情况下,同时打开真空泵并调节旋塞,使气流仅流向干燥器和真空泵,让真空泵运行至少十分钟。
5.然后非常缓慢地转动旋塞,使气流仅流向氮气和干燥器,然后关闭真空泵,让干燥室充满氮气。
6.迅速提起干燥器的盖子,并拧紧里面的锥形管的盖子,然后关闭氮气。
注意,锥形管的盖子要盖得足够快,避免氧气重新进入,阻碍聚合反应。
7.将样品置于37°的暖室中轻轻摇晃两小时。
8.为了去除未反应的多聚甲醛,可以将样品放入50 mL透明溶液中,并在37°C下轻轻摇晃清洗24小时,总共重复三次。
注意,这种含有多聚甲醛的透明溶液必须遵循政府和机构规定,作为危险废物丢弃。
第3阶段 组织透明化
1.将样品添加到ETC室并盖上盖子,并连接所有剩余未连接的管道。
2.首先将SDS透明化溶液注入测量容器,然后将其放置在高出热交换器和泵几英寸的表面上,使缓冲液充满管道。
3.启动泵并根据需要向测量容器中添加更多SDS透明化溶液,以填充整个系统。
4.将电极连接至导线并启动电源。电压一般建议使用40 V左右。
注意:除非确认流速合适,否则切勿启动电源。
另外,关闭系统时,务必先切断电源,然后再停止泵的运行。
5.定期检查样品,确定系统是否正常运行、透明化是否正在进行。整个过程大概需要几天时间。
6.从ETC系统中取出透明化的样品,用清水清洗两次,每次24小时。
第4阶段 透明组织免疫荧光染色
1.完成透明化后,将组织浸入0.1% PBST(含0.1% Triton X-100)中,37℃摇床清洗3次,每次24小时,以去除残留SDS并增强抗体渗透性。
2.使用 3-5倍于常规切片浓度的一抗,以0.1% PBST稀释后,37℃孵育2-7天(根据组织厚度调整时间)。
提示:若需标记胞内抗原(如EpCAM),可增加透化剂Triton X-100浓度至0.5%。
3.一抗清洗后(0.01% PBST清洗1-3天),以 1:50~1:100稀释荧光二抗(如AF594标记抗兔IgG),37℃避光孵育2-7天。
4.加入 DAPI(1 μg/mL)染核5-10分钟,再次清洗并避光保存于PBST中。
第5阶段 折射率校正与成像
1.将样品放入折射率校正液中,孵育一天,然后转移至新鲜折射率校正液中再孵育一天,确保溶液的量足以完全覆盖组织。
注意:因折射率校正液中的水分蒸发会导致溶液的折射率发生变化,从而降低光学透明的有效性,所以需确保装有样品和折射率校正液的容器完全密封且不透气。
2.将透明样品安装在玻璃载玻片和黑色 Willco皿之间,对透明样品进行成像,
3.将样品放入Blu-Tack片之间,并添加约20 μL折射率校正液。
4.将有唇边的一面朝上,用力将Willco皿向下压到粘合剂上,直到其刚好接触样品。
5.使用移液器,粘合剂之间的间隙中添加折射率校正液,直到成像室被填满。
6. 将能快速固化的粘合剂KWIK-SIL小心地添加到 Blu-Tack之间的缝隙中,以密封样品,注意不要引入任何气泡。
7.用铝箔覆盖,固化20分钟后,样本即可进行成像。
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