CLARITY（Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/Immunostaining/Insitu hybridization-compatible Tissue hYdrogel）是一种革命性的组织透明化与染色技术，通过结合水凝胶固定和脂质去除，实现了对完整生物组织的三维成像与分析。
CLARITY技术的主要用途是将完整的生物组织（如大脑、肝脏等）转化为透明状态，同时保留组织内的生物分子（如蛋白质、核酸等）的原位信息。这种技术使得科学家能够在不切片的情况下，对组织进行三维成像，观察神经网络、细胞间联系、亚细胞结构等细节。
CLARITY技术的核心原理是将组织浸泡在纳米多孔水凝胶中，使水凝胶与组织中的生物分子（如蛋白质、核酸等）形成共价键连接，从而固定组织结构。随后，通过电泳技术，利用带电的十二烷基硫酸钠（SDS）胶束去除组织中的脂质，使组织变得透明。最后，通过折射率匹配溶液（如FocusClear或甘油溶液）进一步优化透明效果。
组织选择
原则上，任何年龄、任何动物的任何组织类型（无论是否带有荧光）均可使用。在之前研究人员的论文报道中，证明了 CLARITY 兼容成年小鼠全脑、成年斑马鱼全脑以及福尔马林固定的死后人脑切片。
没有荧光蛋白的组织可以按照本方案描述用抗体或RNA探针标记，以便成像；如果是具有强荧光蛋白表达的组织，可以忽略本方案中免疫荧光染色的步骤进行CLARITY处理，然后经过折射率校正和封片后直接成像。
溶液制备
1.水凝胶单体溶液
将所有试剂放在冰上，将1 g水溶性偶氮引发剂（如VA-044）溶解在10 mL超纯水中，制备10%的引发剂溶液原液。
然后按照以下配方制备溶液（每份组织样本需要80 mL）：
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注意，低温可以有效避免水凝胶聚合反应，所以整个过程中，确保所有试剂和最终溶液始终置于冰上。
该溶液可在-20°C下永久保存。
2.SDS透明化溶液
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使用硼酸将以上溶液的pH值调整至8.5。
3.PBST（含0.1% Triton-X 和 0.1% 叠氮化钠）
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4.折射率校正液
该溶液由23.5% (w/v) N-甲基-D-葡糖胺、29.4% (w/v) 泛影酸和 32.4% (w/v) 碘克沙醇在水中组成。
具体配方如下：
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注意：按照以上顺序添加试剂，每一步都需用搅拌棒充分搅拌，确保粉末完全溶解（必要时可摇晃，但不能加热，否则会导致溶液颜色改变）。
因少量水分蒸发就会导致沉淀，所以存放时可用胶带或者封口膜密封，切记不能让水分流失。
实验操作
第 1 阶段 灌注和组织准备
1.准备好新鲜配置的水凝胶单体溶液，如果是冷冻的原液，需要在4?C或冰上完全解冻至呈现完全透明的状态。
注意，确保溶液中没有沉淀或气泡。
2.用 beuthanasia-D（一般用量，腹膜内每1 kg体重0.5 mL）对动物进行深度麻醉。
3.利用手术刀打开胸腔，在腹部中线切口向前端分叉成Y形切口。然后在右心房打一个小孔，将注射针插入左心室进行灌注。
注意：涉及动物的实验必须遵守政府和机构的规定。动物在进行切口前必须完全麻醉。
4.准备两个注射器，分别装有冰冷的PBS和水凝胶单体溶液，每个溶液都有翼状针头组。
· 对于小鼠，先以小于5 mL/min的速度灌注20 mL冰冷的PBS，小心地拔出针头，再灌注20 mL冰冷的水凝胶单体溶液。
· 对于大鼠，则每种溶液需要约200 mL，并以20 mL/min的速度进行灌注。
注意：保持缓慢的灌注速度，效果更佳。
同时，灌注时一定要避免将气泡引入血管（尤其是在插入针头时）。
5.小心取出目标器官，立即将它们放入装有20 mL冰冷水凝胶单体溶液的50 mL锥形管中，并置于冰上孵育一天，以进行后固定和单体的均匀渗透。
6.将样品在4℃下孵育一天，以使单体和引发分子进一步分布在整个组织中。
第2阶段 水凝胶组织包埋
1.将在水凝胶单体溶液中孵育一天后的组织样品移至10 mL新鲜水凝胶单体溶液中。
2.将锥形管放入管架上的干燥室中，并将盖子拧开一半。以便去除水凝胶-组织杂交过程中的氧气，防止氧自由基终止聚合反应。
3 .通过三通旋塞阀将氮气和真空泵与干燥器连接，打开三个方向的气流并打开氮气，让气体流动约5秒钟，以冲洗管道中残留的氧气。
4.为避免氧气扩散回管道，在不关闭氮气流的情况下，同时打开真空泵并调节旋塞，使气流仅流向干燥器和真空泵，让真空泵运行至少十分钟。
5.然后非常缓慢地转动旋塞，使气流仅流向氮气和干燥器，然后关闭真空泵，让干燥室充满氮气。
6.迅速提起干燥器的盖子，并拧紧里面的锥形管的盖子，然后关闭氮气。
注意，锥形管的盖子要盖得足够快，避免氧气重新进入，阻碍聚合反应。
7.将样品置于37°的暖室中轻轻摇晃两小时。
8.为了去除未反应的多聚甲醛，可以将样品放入50 mL透明溶液中，并在37°C下轻轻摇晃清洗24小时，总共重复三次。
注意，这种含有多聚甲醛的透明溶液必须遵循政府和机构规定，作为危险废物丢弃。
第3阶段 组织透明化
1.将样品添加到ETC室并盖上盖子，并连接所有剩余未连接的管道。
2.首先将SDS透明化溶液注入测量容器，然后将其放置在高出热交换器和泵几英寸的表面上，使缓冲液充满管道。
3.启动泵并根据需要向测量容器中添加更多SDS透明化溶液，以填充整个系统。
4.将电极连接至导线并启动电源。电压一般建议使用40 V左右。
注意：除非确认流速合适，否则切勿启动电源。
另外，关闭系统时，务必先切断电源，然后再停止泵的运行。
5.定期检查样品，确定系统是否正常运行、透明化是否正在进行。整个过程大概需要几天时间。
6.从ETC系统中取出透明化的样品，用清水清洗两次，每次24小时。
第4阶段 透明组织免疫荧光染色
1.完成透明化后，将组织浸入0.1% PBST（含0.1% Triton X-100）中，37℃摇床清洗3次，每次24小时，以去除残留SDS并增强抗体渗透性。
2.使用 3-5倍于常规切片浓度的一抗，以0.1% PBST稀释后，37℃孵育2-7天（根据组织厚度调整时间）。
提示：若需标记胞内抗原（如EpCAM），可增加透化剂Triton X-100浓度至0.5%。
3.一抗清洗后（0.01% PBST清洗1-3天），以 1:50~1:100稀释荧光二抗（如AF594标记抗兔IgG），37℃避光孵育2-7天。
4.加入 DAPI（1 μg/mL）染核5-10分钟，再次清洗并避光保存于PBST中。
第5阶段 折射率校正与成像
1.将样品放入折射率校正液中，孵育一天，然后转移至新鲜折射率校正液中再孵育一天，确保溶液的量足以完全覆盖组织。
注意：因折射率校正液中的水分蒸发会导致溶液的折射率发生变化，从而降低光学透明的有效性，所以需确保装有样品和折射率校正液的容器完全密封且不透气。
2.将透明样品安装在玻璃载玻片和黑色 Willco皿之间，对透明样品进行成像，
3.将样品放入Blu-Tack片之间，并添加约20 μL折射率校正液。
4.将有唇边的一面朝上，用力将Willco皿向下压到粘合剂上，直到其刚好接触样品。
5.使用移液器，粘合剂之间的间隙中添加折射率校正液，直到成像室被填满。
6. 将能快速固化的粘合剂KWIK-SIL小心地添加到 Blu-Tack之间的缝隙中，以密封样品，注意不要引入任何气泡。
7.用铝箔覆盖，固化20分钟后，样本即可进行成像。
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