重要事项：本实验步骤对未标记和荧光标记的抗体均适用。请参阅产品网页或产品数据表上的产品使用信息部分，以确定该产品是否已通过验证并批准用于培养细胞系（IF-IC）或冷冻组织切片（IF-F）。
注：某些阿拉丁抗体在使用其他操作步骤时才能发挥最佳性能。请参见产品网页上的实验步骤，了解针对特定产品的建议。
一、甲醛固定的免疫荧光实验步骤
A. 溶液与试剂
注：利用反渗透去离子水（RODI）或同等级别的水制备溶液。
· 1 × Phosphate Buffered Saline（PBS）： 要配制 1 L 1× PBS：添加 100 ml 10× 洗涤缓冲液、磷酸盐缓冲盐水（P492453）到 900 ml dH2O中，混匀。调节 pH 至 8.0。
· 4% 甲醛，不含甲醇 ：使用新鲜溶液。
· 封闭缓冲液：通过添加 0.5 mL 与二抗同一物种来源的正常血清（例如，正常山羊血清（G752123）和 30 μL Triton X-100（T109027）到 9.5 mL 1× PBS 中来制备 1× PBS /5% 正常血清 /0.3% Triton X-100 缓冲液。4°C 保存。
· 抗体稀释缓冲液：通过添加 0.1 g BSA（B265993）和 30 μL Triton X-100 至 10 mL 1× PBS 中来制备 1× PBS / 1% BSA /0.3% Triton X-100 缓冲液。4°C 保存。
· 荧光素偶联的二抗： 使用对您的一抗宿主物种（例如兔子）具有反应性的二抗。单击此处获得批准用于免疫荧光法的二抗列表。
B. 固定
注：所有后续孵育都应在室温（20-25°C）下进行，除非另有说明。
1. 对固定的冷冻组织（IF-F）进行免疫染色（C 部分）。
2. 对于培养的细胞系（IF-IC）或未固定的冷冻组织切片（IF-F），请立即固定，如下所示：
a. 用 4％ 的甲醛将样品覆盖到 2–3 mm 的深度。
b. 让标本在室温下固定 15 分钟。
c. 用 PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
d. 继续进行免疫染色操作（C 部分）。
C. 免疫染色
1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
2. 封闭时，在抗体稀释缓冲液中制备一抗（建议的稀释范围请参见产品网站）。
3. 吸出封闭溶液，然后加入稀释后的一抗。
4. 4°C 温度下孵育过夜。
5. 用 1× PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
注：如果使用荧光物质标记的一抗，则跳转到Ｃ部分，第 8 步。
6. 用抗体稀释缓冲液将荧光素偶联的二抗稀释后，避光孵育标本 1–2 小时。
7. 用 1× PBS 漂洗三次，每次 5 分钟，使其避光。
8. 适当的复染。
注：在您的实验中加入荧光细胞染料（包括 DNA 染料等）时，请参考染料产品页，以了解建议的实验步骤。查看我们的经验证用于免疫荧光分析的细胞染料列表。
9. 安装样品进行成像。
10. 为了长期保存，请在 4°C 下避光保存样品。
二、用于需要甲醇固定的基于细胞测定的免疫荧光实验步骤
A. 溶液与试剂
注：利用反渗透去离子水（RODI）或同等级别的水制备溶液。
1. 1× Phosphate Buffered Saline（PBS）： 要配制 1 L 1× PBS：添加 100 ml 10× 洗涤缓冲液、磷酸盐缓冲盐水（P492453）到 900 ml dH2O 中，混匀。调节 pH 至 8.0。
2. 甲醇：（M116124）100%，使用冰冷溶液。
3. 封闭缓冲液：购买即用型免疫荧光封闭液（B751639），或通过添加 0.5 mL 与二抗同一物种来源的正常血清（例如，正常山羊血清（G752123）和 30 μL Triton X-100（T109027）到 9.5 mL 1× PBS 中来制备 1× PBS /5% 正常血清 /0.3% Triton X-100 缓冲液。4°C 保存。
4. 抗体稀释缓冲液：通过添加 0.1 g BSA（B265993）和 30 μL Triton X-100 至 10 mL 1× PBS 中来制备 1× PBS / 1% BSA /0.3% Triton X-100 缓冲液。4°C 保存。
5. 荧光素偶联的二抗：使用对您的一抗宿主物种（例如兔子）具有反应性的二抗。单击此处获得批准用于免疫荧光法的二抗列表。
B. 固定
注：所有后续孵育都应在室温（20-25°C）下进行，除非另有说明。
1. 然后吸出培养基，并用冰冷的 100％ 甲醇覆盖 2–3 mm 的细胞。
2. 让细胞在冰上或在 4°C 下固定 15 分钟。
3. 用 1× PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
4. 继续进行免疫染色操作（C 部分）。
C. 免疫染色
1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
2. 封闭时，在抗体稀释缓冲液中制备一抗（建议的稀释范围请参见产品网站）。
3. 吸出封闭溶液，然后加入稀释后的一抗。
4. 4°C 温度下孵育过夜。
5. 用 1× PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
注：如果使用荧光物质标记的一抗，则跳转到Ｃ部分，第 8 步。
6. 用抗体稀释缓冲液将荧光素偶联的二抗稀释后，避光孵育标本 1–2 小时。
7. 用 1× PBS 漂洗三次，每次 5 分钟，使其避光。
8. 适当的复染。
注：在您的实验中加入荧光细胞染料（包括 DNA 染料等）时，请参考染料产品页，以了解建议的实验步骤。查看我们的经验证用于免疫荧光分析的细胞染料。
9. 安装样品进行成像。
10. 为了长期保存，请在 4°C 下避光保存样品。
三、甲醇通透的免疫荧光实验步骤（免疫荧光甲醇通透）
A. 溶液与试剂
注：利用反渗透去离子水（RODI）或同等级别的水制备溶液。
1. 1× Phosphate Buffered Saline（PBS）： 要配制 1 L 1× PBS：添加 100 ml 10× 洗涤缓冲液、磷酸盐缓冲盐水（P492453）到 900 ml dH2O 中，混匀。调节pH 至 8.0。
2. 4% 甲醛，不含甲醇：使用新鲜溶液。
3. 甲醇：（M116124）100%，使用冰冷溶液。
4. 封闭缓冲液：购买即用型免疫荧光封闭液（B751639），或通过添加 0.5 mL 与二抗同一物种来源的正常血清（例如，正常山羊血清（G752123）和 30 μL Triton X-100（T109027）到 9.5 mL 1× PBS 中来制备 1× PBS /5% 正常血清 /0.3% Triton X-100 缓冲液。4°C 保存。
5. 抗体稀释缓冲液：通过添加 0.1 g BSA（B265993）和 30 μL Triton X-100 至 10 mL 1× PBS 中来制备 1× PBS / 1% BSA /0.3% Triton X-100 缓冲液。4°C 保存。
6. 荧光素偶联的二抗：使用对您的一抗宿主物种（例如兔子）具有反应性的二抗。单击此处获得批准用于免疫荧光法的二抗列表。
B. 固定
注：所有后续孵育都应在室温（20-25°C）下进行，除非另有说明。
1. 对固定的冷冻组织（IF-F）进行免疫染色（C 部分）。
2. 对于培养的细胞系（IF-IC）或未固定的冷冻组织切片（IF-F），请立即固定，如下所示：
a. 用 4％ 的甲醛将样品覆盖到 2–3 mm 的深度。
b. 让标本在室温下固定 15 分钟。
c. 用 PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
d. 继续进行免疫染色操作（C 部分）。
C. 免疫染色
注：所有随后的孵育都应当在室温下完成，除非另外注明需要在潮湿光密盒或带盖的培养皿/板中孵育，以防止干燥和荧光物质淬灭。
1. 甲醇通透化步骤：用冰冷的 100％ 甲醇覆盖样品至 2-3 mm 的深度，然后在冰上或 4°C 下孵育 10 分钟。
2. 用 1× PBS 漂洗三次。
3. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
4. 封闭时，在抗体稀释缓冲液中制备一抗（建议的稀释范围请参见产品网站）。
5. 吸出封闭溶液，然后加入稀释后的一抗。
6. 4°C 温度下孵育过夜。
7. 用 1× PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
注：如果使用荧光物质标记的一抗，则跳转到 Ｃ部分，第 10 步。
8. 用抗体稀释缓冲液将荧光素偶联的二抗稀释后，避光孵育标本 1–2 小时。
9. 用 1× PBS 漂洗三次，每次 5 分钟，使其避光。
10. 适当的复染。
注：在您的实验中加入荧光细胞染料（包括 DNA 染料等）时，请参考染料产品页，以了解建议的实验步骤。查看我们的经验证用于免疫荧光分析的细胞染料列表。
11. 安装样品进行成像。
为了长期保存，请在 4°C 下避光保存样品。
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