细胞培养是一项艰难的工作。因为这是一个高度技术性的过程，当你从一个来源提取细胞并在另一个条件下去对他们进行操作时，可能会出现很多问题，比如受到外界的污染，或者生长速度非常缓慢。

但其中也有许多是我们可以去控制的。在过去的100多年里，贴壁细胞培养实验为现代医学的一些最具革命性的进步做出了贡献，促进了我们对癌症等疾病的理解，并支撑了安全有效的治疗方法的发展。

幸运的是，现在人们对细胞培养的了解比20世纪初体外培养先驱罗斯·哈里森（Ross Harrison）在玻片上分析青蛙组织时多得多。在本指南中，我们分享了一个多世纪来培育活细胞的基本知识，包括如何接种、增殖和收获。

低温状态下的细胞接种

在购买细胞培养品系时，产品是冷冻保存的，这对长期保持细胞活力是必要的。在这种状态下，你需要解冻并进行细胞接种，这个过程应当是非常谨慎小心的，即便它发生得很快。然而，这一重要的步骤的经常匆忙进行，有时很多细节甚至被忽视，这就存在了细胞被污染的风险，也没有给细胞提供它们所需要的良好的、无菌的开始。

以下是进行细胞接种的正确方法：

• 准备好所需的所有的器具。你需要一个冷冻的小瓶子、一个烧杯或水浴槽，装满预热的水，和一个装有预平衡介质的烧瓶。如果你打算降低细胞的活跃度并去除DMSO或其他低温保护剂，你还需要一个锥形瓶用于盛装这些介质。
• 加热小瓶子。在装有预热过的水的烧杯中轻轻搅动冷冻的小瓶子，直到里面的组分几乎完全融化。然后，用酒精湿巾清洁小瓶，以减少被污染的风险。

接种细胞。使用移液管，从冷冻液中取出细胞并转移到烧瓶中。然后用移液器反复吸取混匀溶液，以便接种。这样，你的细胞就会被解冻、转移、并准备好进入培养箱（或用于去除DMSO的离心机）。

细胞数量随着细胞增殖而扩大

当细胞生长到一定密度后，需要对细胞进行分离传代。你需要掌握正确的细胞分离方法。细胞增殖是细胞培养的必要部分，依赖于效率和一致性。如果使用的工作流程效率低下，可能会提高供应和人工成本；如果遵循了前后不一致的工作流程，则可能会给您的细胞带来过度压力，并杀死它们。

达到目的的方式取决于你的对于实验容器的选择。市面上有非常多的选择，比如使用i-Quip®容器，可以帮助生命科学家在更小的空间中建立友好的环境，以实现更快的生长，也更多的减少劳动力和污染风险。

因为不是所有的容器都具有相同的生长面积，研究人员通常会考虑细胞/cm2的产量来决定他们的容器选择和相关试剂的用量。然后，他们将利用这一技术持续地进行细胞接种实验，使其达到研究人员所需的细胞数量。为了获得最佳生长效果，通过以下操作保持细胞/cm2和mL/cm2的比例稳定来选择容器和试剂：

• 使用这个公式来计算您的细胞数量，以容器为单位：[(所需细胞/cm2)×(容器的面积cm2)]；
•  应用这个公式来计算每个容器所需的试剂量：[(期望mL数/ cm2)×(容器的面积cm2)]。为了达到最佳的细胞生长和气体扩散，大多数情况下每cm2的细胞生长面积将需要0.2 mL到0.5 mL的培养基。

收获你的贴壁细胞

当细胞在显微镜下呈现为单层时，你就知道它们已经准备好被收获了。实验员们一般会通过化学或物理手段分离细胞。

一种方法是通过解离试剂进行化学分离，需要针对细胞类型和应用进行优化，以确保细胞不受试剂的负面影响。相比之下，对于可能不耐受解离试剂的强黏附、敏感细胞，通过细胞刮除器进行物理清除可能是更好的方法。同时还需要考虑下游应用场景，以及如何或是否解离试剂可能影响您的研究。

如果您选择使用解离试剂，请使用移液管无菌地遵循以下操作步骤：

•  从培养瓶中取出培养基；
•  向培养瓶中加入PBS等缓冲溶液，以去除可能干扰解离剂的任何微量血清。轻轻摇动容器，使里面的溶液均匀。浸泡10到15分钟以分离哪些难以分离的细胞系。移去缓冲液；
• 以0.02到0.03 mL/cm2的比例添加解离试剂。根据细胞系或解离试剂的特性，在37℃孵育可以促进解离；
•  当细胞状态呈现圆形，但还没有开始聚集时，它们就已经准备好了——就好像你在看一个充满了成千上万颗星星的夜空。溶液开始变得浑浊是一个好迹象，表明它们已经准备好被分离了；
•  用缓冲液或含血清的培养基稀释解离试剂，通常以1:1的比例稀释。在去除整个溶液并将其转移到试管内之前，上下吸取几次以混匀；
•  如果细胞对试剂特别敏感，则建议通过离心法实现细胞的分离。

现在你的细胞可以计数了，同时也可以对其细胞密度和活力进行测量了。

通过细胞培养达成你的研究

贴壁细胞培养可以为你的实验室打开一个实验和下游应用的全新世界——它同样也可以很有趣。但当你操纵活体细胞时，可能会有很多风险，所以正确的操作非常重要。通过遵循这些基本的指示，并努力达成更完善的操作流程，你可以逐步成长为一个细胞培养专家。